2.2 UV-VIS
法測定靈芝孢子粉中靈芝多醣的含量
[5-8]
2.2.1
測定波長的選擇
精密量取標準品儲備液
2mL
，
置
25mL
容量瓶中，
加水
至刻度，搖勻後，精密量取
2mL
，置具塞試管中，精密加入硫酸
-
蒽酮溶液
(
精密量取
蒽酮
0.1g
，加入
80%
的硫酸溶液
100mL
中，使溶解，搖勻
)6mL
，搖勻，置沸水浴
中加熱
15min
，
取出，
放入冰浴中冷卻
15min
，
取出。
同時以蒸餾水
2mL
平行操作，
作為空白，在
400
～
800nm
範圍內對標準品溶液進行波長掃描。結果在波長
625nm
處有最大吸收，如圖
3
，因此實驗測定波長為
625nm
。
圖
3
葡萄糖標準品的
UV
圖譜
2.2.2
標準品儲備液的製備
精密稱取
105
℃乾燥至恆重的無水葡萄糖
0.0744g
，
置
100mL
容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻即得。
2.2.3
樣品溶液的製備
取靈芝孢子粉約
0.6g
，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密
加水
90mL
，加熱回流
3h
，放冷，搖勻，離心，提取液轉移至
100mL
容量瓶中，加
水稀釋至刻度，搖勻，精密量取
10mL
，加入乙醇
150mL
，搖勻，
4
℃放置
12h
，取
出，離心，傾去上清液，沉澱加水溶解並轉移至
25mL
容量瓶中，加水稀釋至刻度，
搖勻，即得樣品溶液。
2.2.4
標準曲線
精密量取標準品儲備液
0
、
1
、
2.5
、
3.5
、
4
、
8mL
，分別置
50mL
容量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取上述各溶液
2mL
，置具塞試管中，精
密加入硫酸
-
蒽酮溶液
6mL
，
置沸水浴中加熱
15min
，
取出，
放入冰浴中冷卻
15min
，
以第一管為空白，在
625nm
波長處測定吸光度，以標準品濃度
X(μg/m
L)
為橫坐標，
吸光度值為縱坐標，繪製標準曲線。經計算得回歸方程為
Y=0.0091X
，
r=0.9991
，
對方程檢驗，
F=148.902
，
P<0.01
，
有統計學意義。
結果表明，
在
14.9
～
119.1μg/mL
的範圍內，
葡萄糖標準品溶液濃度與吸光度線性關係良好。
標準品的
UV
圖譜見圖
4A
。
圖
4
靈芝多醣
UV
譜圖
A-
葡萄糖標準品
B-
樣品
2.2.5
精密度試驗
精密量取標準品儲備液
2mL
，
置
25mL
容量瓶中，
加水至刻
度，搖勻後精密量取
2mL
，
按照
“2.3.2”
項下方法顯色，
在
625nm
處測定吸光度，連
續測定
5
次，吸光度平均值為
0.5654
，
RSD
為
0.24%
，表明方法精密度良好。
2.2.6
穩定性試驗
精密量取標準品儲備液
2mL
，
置
25mL
容量瓶中，
加水至刻
度，搖勻後精密量取
2mL
，照
“2.3.2”
項下方法顯色，每隔
0
、
5
、
10min
、
20
、
30
、
40
、
60
分鐘測定標準品溶液在
625nm
處的吸光度值，至第
30
分鐘時，
5
次測量結
果吸光度平均值為
0.5575(n=5)
，
RSD
為
0.72%
，結果表明，顯色在
30min
之內
穩定。
2.2.7
回收率試驗
取靈芝孢子粉樣品
5
份，
每份約
1g
，
精密稱定後分別加入一
定量的葡萄糖標準品，按照
“2.3.3”
項下方法進行製備，在
625nm
處測定吸光度併計
算加樣回收率，結果見表
3
。
2.2.8
樣品測定
將樣品溶液照
“2.3.2”
項下的方法顯色，
在
625nm
處測定吸光
度併計算含量，結果見表
4
，樣品
UV
圖譜見圖
4B
。
表
3
加樣回收率測定結果（
%
，
n
=5
，
±
s
）
Tab. 3 Recoveries of polysaccharides constituents
（
%
，
n
=5
，
±
s
）
批號
取
樣量
（
g
）
樣品中
靈芝多醣含
量（
mg
）
添加葡萄
糖標準品含量
（
mg
）
實測靈
芝多醣含量
（
mg
）
回
收率
（
%
）
±
s
R
SD
（
%
）
2005040
7
1.17
13.48
10.57
24.63
1
02.4
1
01.4
±
3.1
3
.14
1.08
12.44
10.57
22.71
9
8.7
0.89
10.25
10.57
21.6
1
1
03.8
1
.21
13.9
4
10.57
25.5
1
1
04.1
1
.14
13.1
3
10.57
23.1
3
9
7.6
表
4
含量測定結果
（
%
，
n
=5
，
±
s
）
Tab. 4 Contents of samples
（
%
，
n
=5
，
±
s
））
3
討論
對靈芝三萜類成分的含量測定採用
HPLC
法。
用
HPLC
法測定了靈芝孢子粉中靈芝
酸
C2
的含量，標準品其純度經
HPLC
檢查，大於
98%
，符合標準品的要求。選擇流
動相時，
甲醇與水的配比對樣品的分離影響較大，
結果表明甲醇比水
55
∶
45
的配比在
本實驗條件下較為合適。
加入
1%
的冰醋酸的目的是為了減少峰的脫尾。
另外在樣品提
取處理時，對超聲、回流時間進行了考察，比較了超聲
15min
及
30min
，回流
1h
、
4h
、
9h
的提取效果。測定結果表明超聲
30min
、回流
4h
已將樣品提取完全，並且雜
質較少，從而確定提取時間。
對靈芝孢子粉中的靈芝多醣採用
UV-VIS
法進行含量測定。
影響多醣含量測定的因
素很多，
各種顯色方法測定的結果也不同，
2005
版藥典中使用的蒽酮
-
硫酸比色法同苯
酚
-
硫酸法、
地衣酚比色法相比，
顯色試劑配製簡便快捷，
方法簡單可靠，
顯色穩定性、
重現性好，
因此實驗中選用該方法。
但測定過程中冷卻、
加熱時間與氧化還原作用有關，
因此要準確控制時間。在待測溶液中加入硫酸
-
蒽酮溶液後要充分振盪混勻，置沸水浴
中加熱時間也需嚴格控制，以免影響測定結果。
法測定靈芝孢子粉中靈芝多醣的含量
[5-8]
2.2.1
測定波長的選擇
精密量取標準品儲備液
2mL
，
置
25mL
容量瓶中，
加水
至刻度，搖勻後，精密量取
2mL
，置具塞試管中，精密加入硫酸
-
蒽酮溶液
(
精密量取
蒽酮
0.1g
，加入
80%
的硫酸溶液
100mL
中，使溶解，搖勻
)6mL
，搖勻，置沸水浴
中加熱
15min
，
取出，
放入冰浴中冷卻
15min
，
取出。
同時以蒸餾水
2mL
平行操作，
作為空白，在
400
～
800nm
範圍內對標準品溶液進行波長掃描。結果在波長
625nm
處有最大吸收，如圖
3
，因此實驗測定波長為
625nm
。
圖
3
葡萄糖標準品的
UV
圖譜
2.2.2
標準品儲備液的製備
精密稱取
105
℃乾燥至恆重的無水葡萄糖
0.0744g
，
置
100mL
容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻即得。
2.2.3
樣品溶液的製備
取靈芝孢子粉約
0.6g
，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密
加水
90mL
，加熱回流
3h
，放冷，搖勻，離心，提取液轉移至
100mL
容量瓶中，加
水稀釋至刻度，搖勻，精密量取
10mL
，加入乙醇
150mL
，搖勻，
4
℃放置
12h
，取
出，離心，傾去上清液，沉澱加水溶解並轉移至
25mL
容量瓶中，加水稀釋至刻度，
搖勻，即得樣品溶液。
2.2.4
標準曲線
精密量取標準品儲備液
0
、
1
、
2.5
、
3.5
、
4
、
8mL
，分別置
50mL
容量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取上述各溶液
2mL
，置具塞試管中，精
密加入硫酸
-
蒽酮溶液
6mL
，
置沸水浴中加熱
15min
，
取出，
放入冰浴中冷卻
15min
，
以第一管為空白，在
625nm
波長處測定吸光度，以標準品濃度
X(μg/m
L)
為橫坐標，
吸光度值為縱坐標，繪製標準曲線。經計算得回歸方程為
Y=0.0091X
，
r=0.9991
，
對方程檢驗，
F=148.902
，
P<0.01
，
有統計學意義。
結果表明，
在
14.9
～
119.1μg/mL
的範圍內，
葡萄糖標準品溶液濃度與吸光度線性關係良好。
標準品的
UV
圖譜見圖
4A
。
圖
4
靈芝多醣
UV
譜圖
A-
葡萄糖標準品
B-
樣品
2.2.5
精密度試驗
精密量取標準品儲備液
2mL
，
置
25mL
容量瓶中，
加水至刻
度，搖勻後精密量取
2mL
，
按照
“2.3.2”
項下方法顯色，
在
625nm
處測定吸光度，連
續測定
5
次，吸光度平均值為
0.5654
，
RSD
為
0.24%
，表明方法精密度良好。
2.2.6
穩定性試驗
精密量取標準品儲備液
2mL
，
置
25mL
容量瓶中，
加水至刻
度，搖勻後精密量取
2mL
，照
“2.3.2”
項下方法顯色，每隔
0
、
5
、
10min
、
20
、
30
、
40
、
60
分鐘測定標準品溶液在
625nm
處的吸光度值，至第
30
分鐘時，
5
次測量結
果吸光度平均值為
0.5575(n=5)
，
RSD
為
0.72%
，結果表明，顯色在
30min
之內
穩定。
2.2.7
回收率試驗
取靈芝孢子粉樣品
5
份，
每份約
1g
，
精密稱定後分別加入一
定量的葡萄糖標準品，按照
“2.3.3”
項下方法進行製備，在
625nm
處測定吸光度併計
算加樣回收率，結果見表
3
。
2.2.8
樣品測定
將樣品溶液照
“2.3.2”
項下的方法顯色，
在
625nm
處測定吸光
度併計算含量，結果見表
4
，樣品
UV
圖譜見圖
4B
。
表
3
加樣回收率測定結果（
%
，
n
=5
，
±
s
）
Tab. 3 Recoveries of polysaccharides constituents
（
%
，
n
=5
，
±
s
）
批號
取
樣量
（
g
）
樣品中
靈芝多醣含
量（
mg
）
添加葡萄
糖標準品含量
（
mg
）
實測靈
芝多醣含量
（
mg
）
回
收率
（
%
）
±
s
R
SD
（
%
）
2005040
7
1.17
13.48
10.57
24.63
1
02.4
1
01.4
±
3.1
3
.14
1.08
12.44
10.57
22.71
9
8.7
0.89
10.25
10.57
21.6
1
1
03.8
1
.21
13.9
4
10.57
25.5
1
1
04.1
1
.14
13.1
3
10.57
23.1
3
9
7.6
表
4
含量測定結果
（
%
，
n
=5
，
±
s
）
Tab. 4 Contents of samples
（
%
，
n
=5
，
±
s
））
3
討論
對靈芝三萜類成分的含量測定採用
HPLC
法。
用
HPLC
法測定了靈芝孢子粉中靈芝
酸
C2
的含量，標準品其純度經
HPLC
檢查，大於
98%
，符合標準品的要求。選擇流
動相時，
甲醇與水的配比對樣品的分離影響較大，
結果表明甲醇比水
55
∶
45
的配比在
本實驗條件下較為合適。
加入
1%
的冰醋酸的目的是為了減少峰的脫尾。
另外在樣品提
取處理時，對超聲、回流時間進行了考察，比較了超聲
15min
及
30min
，回流
1h
、
4h
、
9h
的提取效果。測定結果表明超聲
30min
、回流
4h
已將樣品提取完全，並且雜
質較少，從而確定提取時間。
對靈芝孢子粉中的靈芝多醣採用
UV-VIS
法進行含量測定。
影響多醣含量測定的因
素很多，
各種顯色方法測定的結果也不同，
2005
版藥典中使用的蒽酮
-
硫酸比色法同苯
酚
-
硫酸法、
地衣酚比色法相比，
顯色試劑配製簡便快捷，
方法簡單可靠，
顯色穩定性、
重現性好，
因此實驗中選用該方法。
但測定過程中冷卻、
加熱時間與氧化還原作用有關，
因此要準確控制時間。在待測溶液中加入硫酸
-
蒽酮溶液後要充分振盪混勻，置沸水浴
中加熱時間也需嚴格控制，以免影響測定結果。
沒有留言:
張貼留言