靈芝孢子粉對人肝癌細胞HepG2及裸鼠移植瘤生長的抑製作用

背景資料靈芝是擔子菌綱多孔科靈芝屬真菌, 公認為扶正固本, 滋補強壯的傳統中藥. 臨床報導孢子粉可改善機體的免疫功能, 防治癌症, 減輕患者對放、化療的不良反應. ■同行評議者張吉翔, 教授, 南昌大學第二附屬醫院消化內科王順官, 等. 靈芝孢子粉對人肝癌細胞HepG2及裸鼠移植瘤生長的抑製作用1115 www.wjgnet.com 制腫瘤細胞生長的作用. 關鍵詞: 靈芝孢子粉; HepG2; 肝癌; 四唑鹽比色法王順官, 王筱婧, 李琳, 徐江平. 靈芝孢子粉對人肝癌細胞HepG2及裸鼠移植瘤生長的抑製作用. 世界華人消化雜誌2008 ; 16(10): 1114-1118 0 引言靈芝是擔子菌綱多孔科靈芝屬真菌, 其生長成熟後所散發出來的孢子體即靈芝孢子粉. 靈芝孢子粉富含多醣肽, 有機鍺, 多種氨基酸, 脂肪酸及微量元素等成份. 臨床報導孢子粉可改善機體的免疫功能, 防治癌症, 減輕患者對放、化療的不良反應. 以往藥理研究表明, 靈芝孢子粉可增強免疫功能, 並對多種移植性動物腫瘤有明顯的抑製作用[1-3] . 但靈芝孢子粉對體外培養人癌細胞的直接作用及人癌裸鼠移植瘤治療作用的研究則較少. 本文報導靈芝孢子粉體外對人肝癌細胞株HepG2生長的抑製作用及對裸小鼠人HepG2移植瘤的抗腫瘤作用的研究.1 材料和方法1.1 材料HepG2為人肝癌細胞株, 武漢大學中國典型培養物保藏中心, 用DMEM培養基(含100 mL/L小牛血清, 青黴素100 kU/L, 鏈黴素100 mg/L), 37℃, 50 mL/L CO2培養. 實驗動物為6-9 wk齡BALB/c裸小鼠, 22-30 g, 23只, 雌雄兼有, 無特定病原體(SPF)條件下飼養, 由南方醫科大學動物實驗中心提供. 靈芝孢子粉(B), 廣州盈康科技有限公司提供. 5-氟脲嘧啶(5-Fluorouracil, 5-FU), 江蘇南通精華製藥有限公司產品. 噻唑藍(MTT), Sigma產品, 北京鼎國公司分裝, 用PBS配製成5 g/L溶液, 無菌濾膜過濾, 4℃避光保存. 1.2 方法1.2.1 體外細胞毒實驗(MTT法): 按照Mosmann et al[4] 描述的方法進行實驗. 取對數生長期的HepG2細胞, 2.5 g/L胰酶消化成單個細胞, 配製細胞懸液, 計數板計數為5×107 cell/L, 於96孔培養板內每孔接種100 µL(每孔含5×103 個細胞, 經反复實驗得出較為合適的細胞數目), 放入培養箱中孵育, 24 h貼壁棄上清液, 加入180 µL DMEM培養基繼續孵育24 h使細胞生長同步化. 用加入終濃度為10 g/L DMSO的DMEM配製靈芝孢子粉B, 設5個濃度, 5 g/L、2.5 g/L、1.25 g/L、0.625 g/L、0.3125 g/L, 並用0.22 µm微孔濾膜過濾除菌. 陽性對照5-FU DMEM稀釋, 使終濃度為180 mg/L(通過從250 mg/L、180 mg/L、150 mg/L、120 mg/L、90 mg/L、60 mg/L等6個濃度中篩選出較合適濃度). 並設調零孔, 空白對照及等體積DMSO溶劑對照, 每組設5-6個平行孔. 待HepG2細胞同步化完成後, 加入藥物20 µL/孔, 空白孔加入等量DMEM. 放入孵箱中分別孵育24 h、48 h、72 h、96 h後, 每孔加入MTT 20 µL, 放入孵箱繼續孵育4-6 h. 終止培養, 小心吸棄孔內培養液上清, 每孔加入DMSO 150 µL, 振搖15 min, 使甲臢結晶充分溶解. 於酶標儀570 nm處測各孔A值, 併計算藥物對細胞生長的抑制率, 抑制率= (1-給藥組平均A值/對照組平均A值)×100%. 以上每組實驗重複3次, 並用Logit法計算半數抑制濃度IC50值. 1.2.2 體內抑瘤實驗(人肝癌細胞HepG2裸鼠移植瘤的生長抑制實驗): 取對數生長期的人肝癌HepG2細胞, 2.5 g/L胰酶消化後, 用無血清DMEM配成1×1010 cell/L的單細胞懸液. 在無菌條件下接種於裸鼠腋窩皮下, 0.2 mL/只(相當於每隻裸鼠接種2×106個腫瘤細胞)[5]. 接種1 wk後可見腫瘤生長, 當腫瘤大小到直徑約為3-4 mm時(接種10 d以後), 將荷瘤裸鼠按腫瘤大小隨機分為3組, 每組7-8只裸鼠, 雌雄兼有, (1)空白組: 生理鹽水100 mL/kg, ig, 每日給藥; (2)陽性對照組: 5-FU, 用生理鹽水稀釋, 無菌分裝, 20 mg/kg, ip, 隔日給藥; (3)給藥組: 靈芝孢子粉B, 5 g /L CMC-Na配製, 高壓滅菌, 2000 mg/kg, ig, 每日給藥. 共給藥21 d. 自接種後每日測量裸鼠體質量, 每周用游標卡尺測量裸鼠腫瘤的長(a)短(b)徑, 並按以下公式計算相對體積. V = 0.5ab2, 各組按時間點的平均瘤體積作生長曲線圖. 末次給藥後24 h時處死動物, 剝離腫瘤稱質量. 做大體和病理觀察, 部分腫瘤組織用40 g/L多聚甲醛固定, 石蠟包埋, 連續4 µm切片, HE染色, 光鏡下觀察肝癌細胞壞死, 形態改變情況. 計算各組抑瘤率, 抑瘤率= (1-用藥組平均瘤質量/空白組平均瘤質量)×100%, 實驗重複兩次. 統計學處理用SPSS10.0統計軟件進行分析, 結果以mean±SD表示, 用One -Way ANOVA和t-test進行分析. 給藥組組間比較用LSD法.2 結果2.1 靈芝孢子粉水溶性成份對HepG2細胞的作用靈芝孢子粉水溶性成份對HepG2細胞具有明顯的抑製作用, 隨著時間延長和劑量的增加, 對■研發前沿藥理研究表明, 靈芝孢子粉可增強免疫功能, 並對多種移植性動物腫瘤有明顯的抑製作用. 1116 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界華人消化雜誌２００８年４月８日第１６卷第１０期腫瘤細胞的抑製作用越強, 具有一定的時間和劑量效應關係. B藥對HepG2細胞的IC50值, 隨著作用時間增加而減小,在72 h時達到最低, B藥的IC50值為2.14 g/L, 表明HepG2細胞在72 h時對B藥最為敏感(表1). 空白組和B組作用72 h後鏡下觀察結果, 可看出靈芝孢子粉對HepG2細胞具有明顯的抑製作用(圖1A-B). 2.2 體內抑瘤實驗高劑量的靈芝孢子粉B對裸小鼠移植瘤的生長具有一定抑製作用, 並且對裸鼠體質量增加無影響(表2). 觀察其活動進食狀況均無明顯異常, 表明靈芝孢子粉B對裸鼠的生長並無明顯的毒副作用. 當ig給藥劑量為2000 mg/kg時, 其對裸鼠移植瘤生長的抑制率達到了57.0%(圖2, 表3). 2.3 病理觀察-大體觀對照組腫瘤組織大, 血供豐富, 質脆, 易出血, 界限不清, 不易分離, 切面呈魚肉樣, 靈芝孢子粉治療組腫瘤組織小, 血供不豐富, 界限較為清楚. HE染色鏡下觀察: 對照組表現為腫瘤組織內見小片壞死, 腫瘤細胞生長旺盛, 呈條狀、索狀, 細胞核異型性明顯, 細胞分化較低, 間質血管豐富(圖3A). 靈芝孢子粉治療組表現為腫瘤組織內壞死區增大, 肝癌細胞部分呈梭型, 間質血管較稀少, 有明顯的纖維化形成, 可見腫瘤細胞生長受到抑制(圖3B). ３ 討論靈芝被公認為扶正固本, 滋補強壯的傳統中藥